一、结直肠癌手术面临的挑战与NIR-II荧光成像技术的优势
结直肠癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一，手术切除所有边缘清晰的肿瘤组织仍然是大多数结直肠癌患者的主要治疗方法。然而，肿瘤完全切除仍然面临挑战，包括肿瘤切除不完全、肿瘤切除边缘呈阳性以及肿瘤发生腹膜转移等问题。外科医生在术中主要依靠视觉和触觉进行诊断，缺少实时成像技术的协助，因此很难准确区分粘连、纤维化以及肿瘤病变。近红外荧光成像技术是一种实时成像技术，通过将近红外荧光靶向探针与荧光成像系统相结合，识别肿瘤组织上特定和高表达的分子靶点来区分肿瘤和正常组织。与传统NIR-I相比，NIR-II显著克服了强组织吸收、自身荧光和光子散射等缺点，具有高组织穿透性和高空间分辨率的特点，有望实现精确的肿瘤切除。PE标记的CEACAM-5/CD66e Fc及Avi标签蛋白可用于定量检测CEACAM-5的表达水平和结合活性，为结直肠癌荧光成像研究提供技术工具。
二、CEACAM-5作为结直肠癌成像靶点的依据
CEACAM-5基因在约90%的结直肠癌中过表达，正常组织中CEACAM-5的表达平均比肿瘤组织低约60倍，因此成为结直肠癌的最佳成像靶点。在人大肠癌细胞系中，部分细胞系如HT29-Luc和SW480过表达CEACAM-5，而其他细胞系如colo201和colo320不表达CEACAM-5，这为CEACAM-5作为靶向标志物提供了实验基础。免疫荧光结果显示CEACAM-5分布在细胞膜表面，探针与细胞表面的结合证明了靶向作用的特异性。细胞结合和阻断实验进一步证实，靶向探针只对过表达CEACAM-5的细胞具有靶向性。这些结果表明，CEACAM-5是结直肠癌靶向成像的理想分子靶点。
三、靶向CEACAM-5的NIR-II荧光探针的构建与表征
研究者开发了一种由近红外荧光染料IRDye800CW偶联抗CEACAM-5纳米体构建的荧光探针。通过表面等离子体共振测定不同浓度下探针的亲和力，当荧光分子与蛋白质比值为1.25时亲和力最佳。探针的吸收光谱峰值为776nm，发射光谱峰值为789nm。在NIR-II中，探针在1600nm处仍有NIR-II信号，是较好的NIR-II荧光材料。探针在NIR-I或NIR-II的荧光强度与浓度呈线性关系，且在NIR-II的表现更好。PE标记的CEACAM-5/CD66e Fc及Avi标签蛋白可用于评估探针与CEACAM-5抗原的结合能力，验证其靶向特异性。
四、探针在血管和毛细血管成像中的性能比较
研究者比较了2D5-IRDye800CW在NIR-I与NIR-II小鼠血管和毛细血管成像中的表现。在850nm处的NIR-I与在1000nm和1200nm处的NIR-II下的小鼠脑血管影像显示，与NIR-I成像相比，NIR-II影像可以更清楚地观察到血管结构。NIR-I/II脑血管的荧光横切面强度分布进一步证明该探针在NIR-II的荧光强度更强。小鼠后肢血管在不同NIR-I/II情况下的对比也证明，随着波长的增加，血管成像分辨率也得到增加。模拟血管在脂肪内5mm深度处探针对NIR-I/II的荧光散射情况显示，NIR-I和NIR-II都会发生荧光散射，但在850nm处散射最严重，而在1300nm处几乎没有散射。这些结果表明该探针具有良好的NIR-II成像性能。
五、探针在结直肠癌模型中的体内靶向性与生物分布
在体内特异性及生物分布研究中，探针对HT29-Luc、colo201和HT29-Luc阻断建模小鼠的靶向实验表明，肾脏的荧光信号较强且随时间推移而减弱，给药后24小时肿瘤的荧光强度最强，且对照组无荧光信号，证明了探针在体内的靶向作用良好。给药后24小时小鼠体内各器官中探针的分布表明，探针主要分布于肾脏、肝脏和肿瘤组织。肿瘤的BLI-CT三维重建定位了肿瘤在体内的位置。在NIR-I/II条件下小鼠肠道内肿瘤的荧光信号强度显示，肿瘤在NIR-II的荧光强度更强。原位肿瘤切除后的BLI和HE染色证实发光区域为肿瘤组织。综上，该探针具有较好的靶向性，与NIR-II结合后有较好的指示肿瘤的作用。
六、NIR-II荧光引导下的肿瘤切除手术
在NIR-II荧光引导下进行R0切除结直肠癌的代表性实验中，给药的荷瘤小鼠腹腔暴露后，NIR-II荧光成像显示盲肠和腹膜的荧光信号强于正常组织，能更好地区分正常组织和肿瘤组织。在NIR-II荧光引导下进行原位结直肠肿瘤切除术，肿瘤切除后经NIR-II及BLI成像均未发现有残留的肿瘤，证明该探针结合NIR-II后能更精确地定位肿瘤组织。与NIR-I相比，NIR-II具有更高的肿瘤-背景比。在大肠癌及腹膜癌肿瘤切除手术中，NIR-II成像的盲肠和腹膜荧光信号高于正常肠道组织，与BLI成像结果对应。依次切除原发肿瘤、腹膜转移瘤及残留肿瘤后的BLI成像证明肿瘤已被完全切除。切除肿瘤的病理结果及CEACAM-5的免疫组化染色证明全部切除组织均为肿瘤组织。
