英文标题：Inflammatory and neurodegenerative serum protein biomarkers increase sensitivity to detect clinical and radiographic disease activity in multiple sclerosis
中文标题：炎症与神经退行性血清蛋白标志物，提升多发性硬化症临床及影像学活动检测灵敏度
发表期刊：Nature Communications
影响因子：15.71
研究背景
多发性硬化症（MS）是一种慢性中枢神经系统炎症性脱髓鞘病，临床表现与病程高度异质，病因尚未完全阐明，但炎症反应与神经退行性过程是核心病理驱动因素。筛选疾病特异性标志物，对病程预测、风险分层及炎症机制解析至关重要，而多变量模型能进一步提升预测精准度。当前研究多聚焦血清神经丝轻链（sNfL），但其在疾病复发检测中灵敏度与特异性不足，难以支撑临床决策需求。
研究结果
2.1 定制 20 种疾病活动相关蛋白检测组合
定制检测组合（CAP）的蛋白清单，通过分析 1411 种蛋白与三个核心终点（钆增强病灶、临床复发状态、年复发率）的单变量及多变量关联确定，筛选过程严格控制分析与操作混杂因素。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）虽与疾病活动（DA）、疾病进展（DP）多个终点强相关，但因在研究收尾阶段补充纳入，未参与本次分析。最终确定 20 种核心蛋白构成 CAP，用于后续系统性验证（表 1）。
2.2 单变量分析：多种蛋白与疾病活动指标显著相关
研究正式开展单变量统计学分析前，首先依据各项研究结局指标对入组样本完成分层分组，同时借助箱线图直观展示不同分组下各类血清蛋白浓度的分布差异。针对钆增强(Gd+)病灶这一连续型研究终点，研究将所有样本按照病灶数量划分为四组：无钆增强病灶组、单发钆增强病灶组、双发钆增强病灶组、三处及以上钆增强病灶组，分组结果及蛋白浓度分布详见图1。
图1
本次研究设置两项二元分类结局指标，分别为临床复发状态(Clinical Relapse Status, CRS)与年复发率(Annualized Relapse Rate, ARR)；其中临床复发状态分为临床缓解静止期、临床活动加重期两大组别，年复发率依据临界值划分为低复发率组（年复发次数≤0.2次）与高复发率组（年复发次数≥1.0次）。针对两项二元结局指标，统一按照疾病风险程度划分为阳性组（疾病活动、高复发风险）与阴性组（疾病稳定、低复发风险），各组蛋白浓度分布结果见图2。
图2
本研究选用两种统计学方法完成单变量关联度定量检验：采用斯皮尔曼相关性分析，评估血清蛋白表达浓度与钆增强病灶数目之间的相关关系；采用独立样本学生t检验，对比二元结局指标不同分组之间蛋白浓度的均值差异，所有蛋白与各项研究终点的关联统计结果均汇总于图3。统计结果显示，绝大部分蛋白标志物针对不同研究终点，均保持统一的相关趋势与组间分离趋势；由于钆增强病灶有无和病灶数量两项指标存在内在关联性，因此二者统计结果的一致性具备关键参考价值，所有出现统计量符号相悖的蛋白，均未达到统计学显著差异标准。在全部检测蛋白中，仅CDCP1标志物存在独特的关联规律：该蛋白表达水平与钆增强病灶负荷呈负相关、组间分离结果同样为阴性，但在临床活动期患者体内表达浓度显著上调，而该蛋白水平与年复发率之间未检测出明显统计学关联。
图3
2.3 多变量模型性能远超单变量，NfL 为核心标志物
图 4 汇总了向前变量筛选曲线、回归分析以及分类分析的实验结果，图 5 展示多变量模型整体检测效能与各个蛋白特征的重要性排名。在 Gd 病灶回归分析中，研究采用二维直方图对比病灶真实数量与模型预测数值；分类分析借助 ROC 曲线评价模型判别能力，其中曲线中线为自助抽样均值，带宽用于反映数据结果的不确定性。回归分析视图内同步标注最佳拟合线、均方根误差以及完全吻合对照线。本次分类分析设置三组对照特征集，分别为全部 GFS 蛋白组合、单独 NfL 标志物、剔除 NfL 后的其余全部蛋白，并且通过随机打乱蛋白浓度数值的方式，客观评价各指标的特征重要程度。
图4
研究从三个维度定量评价模型对 Gd 病灶的检测能力，分别为通用疾病活动度（GDA，区分无病灶样本与任意病灶阳性样本）、轻微疾病活动度（SDA，区分无病灶样本与单个病灶样本）、极端疾病活动度（EDA，区分无病灶样本与病灶数量≥3 的样本）。尽管本次模型仅依托 GDA 数据集完成训练，研究依旧同步纳入 SDA、EDA 两项指标开展效能验证，同时对比单 NfL 模型、去除 NfL 后的多蛋白模型之间的性能差异。GFS 全蛋白模型具体效能参数如下：Gd 病灶数量回归 R²=0.280±0.027，GDA 分类 AUROC=0.813±0.015，CRS 分类 AUROC=0.845±0.026，ARR 分类 AUROC=0.803±0.039。
图5
真实病灶数值与模型预测数值对比结果表明：模型会轻微高估无病灶患者的病灶负荷，低估病灶数量≥5 患者的病灶水平，对存在 1-2 个病灶的人群预测准确度最佳，且整体分类模型效果优于回归模型。在所有 Gd 病灶相关分析中，NfL 单指标贡献度最高，但单一 NfL 模型性能弱于 GFS 组合模型，回归分析中差距更为突出；剔除 NfL 后的多蛋白模型效能仍显著高于随机基线，说明其他蛋白具备独立的疾病判别信号。在 CRS、ARR 两项结局指标中，NfL 依旧是单项最优标志物，但优势明显被削弱。GFS 蛋白模型对 CRS 的判别效果优于除 EDA 外的其余终点指标，ARR 的模型表现与 GDA 相近。整体来看，多变量组合模型区分疾病活动与否的能力，显著优于随机基线模型和单变量 NfL 模型，同时剔除 NfL 后的多特征模型 AUROC 值依旧显著高于随机水平。
2.4 蛋白 - 终点关联的生物学解析：异质性病理与分子互作
通过空间功能关联（人类蛋白质图谱、艾伦脑图谱）及 SPOKE 扩展图谱分析，揭示 21 种 CAP 蛋白的生物学背景。STRING 互作网络（评分≥0.7）、马尔可夫聚类及 Enrichr 功能注释显示，这些蛋白富集于 MS 核心病理通路。跨器官蛋白质组学分析排除血液干扰，明确 CAP 蛋白的 MS 特异性定位与细胞来源。图 6a 映射 21 种蛋白与 MS 10 个生物学标志的关联，图 6b 展示 SPOKE 知识图谱（整合 40 余个数据库），为机制研究与药物重定位提供支撑。
图6
研究小结
本研究从三个独立队列中筛选出 20 种与 MS 临床、影像学活动高度相关的 CAP 蛋白。多变量模型性能显著优于单变量 NfL 模型，且剔除 NfL 后的组合仍具统计学意义。NfL 虽单变量相关性最强，但特异性有限；多蛋白组合可全面反映炎症与退行性病理，为 MS 活动机制提供新见解。研究采用机器学习与网络分析的系统生物学框架，揭示 MS 异质性病理与分子串扰，但受横断面设计限制，需纵向研究进一步验证。该成果有望推动临床级 MS 活动度检测试剂开发，助力复发识别、疗效评估及护理质量提升，后续将开展临床验证与应用拓展研究。
多发性硬化生物标志物检测技术：
核心检测技术
多发性硬化生物标志物（如 NfL、GFAP 及本研究 20 种蛋白）的检测以Luminex 液相芯片与MSD 超敏电化学发光为主，辅以 ELISA、Simoa 等技术，适配血清、脑脊液等样本的多因子同步检测需求。
Luminex 液相芯片技术
- 高通量：单孔可同步检测50-100 种标志物，大幅提升检测效率。
- 样本用量少：仅需50μL血清 / 血浆，适配珍稀样本。
- 成本效益高：多指标并行检测降低单指标成本，适合大规模样本筛查。
- 灵敏度达标：检测下限达pg/mL 级，满足多数炎症因子与神经标志物检测需求。
MSD 超敏电化学发光技术
- 超高灵敏度：检测下限达fg/mL 级（0.05-1pg/mL），精准捕捉 NfL、GFAP 等低丰度神经标志物。
- 低基质干扰：电化学发光背景极低，适配血清、脑脊液等复杂生物样本。
- 宽线性范围：覆盖5-6 个数量级，避免高 / 低浓度样本数据失真。
- 重复性优异：板内 CV<6-8%，板间 CV<10%，数据稳定性强。
