上期，我们提到三代宏基因组在组装高质量、完整的MAG上有着显著的优势(NM趋势！子刊三代宏基因组cMAGs研究)，那么除了组装高质量MAG，基于三代宏基因组技术，还可以在哪些研究内容上有所突破呢？
全球热点耐药基因研究
纳米孔长读长宏基因组测序的组装序列N50达20-70 kbp，相较而言，Illumina短读长宏基因组测序的组装序列N50仅为1-2 kbp。长序列的获取显著提升了分析性能：不仅能准确鉴定耐药基因亚型、精细注释遗传环境，还可预测耐药基因在质粒或染色体上的定位、水平转移潜力及宿主菌信息。
基于三代纳米孔宏基因组和二代宏基因组技术，从研究样本中斯里兰卡医院污水中共检出25种ARG type[1]，其中多药耐药、氨基糖苷类、β-内酰胺类、多粘菌素类和四环素类这五种类型在所有样本中占比最高，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是携带抗性基因的主要菌门。
对马肠道样本的研究中[2]，借助三代纳米孔宏基因组技术，在242份马肠道样本的2272份高质量MAG中检测了ARG的分布，在25个耐药类别中共鉴定出266种独特类型的ARG，其中，氨基糖苷抗性基因最为丰富。
图1 基于纳米孔宏基因组测序数据的分类树，显示Pol-WWTP (a)、Kan-WWTP (b)和Mor-WWTP (c)中假定病原体携带的宿主范围和ARGs[1]。
图2 马肠道抗生素耐药基因的分布[2]。
生物合成基因簇（BGC）挖掘
除抗性基因（如ARG）外，生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）作为另一类重要的基因集合类型，近年来也受到研究者广泛关注。然而，受限于短读长测序技术，此前难以从未培养细菌中获取完整的BGC序列，导致其多样性无法准确解析。三代宏基因组技术的应用成功突破了这一技术瓶颈。
在Nature Biotechnology的一项研究中[3]，研究团队开发了一种新型土壤微生物分离与DNA提取技术，耦合优化后的纳米孔长读长测序平台，成功完成土壤宏基因组的高质量测序与组装，并从中分离鉴定出具有全新作用机制的BGCs。通过生物信息学手段，对MAGs在分类学科水平开展了生物合成基因簇（BGC）的识别与定量分析。结果显示，数据集平均每个科每百万碱基对（Mbp）携带1.3±0.7个BGC；其中UBA5704、假诺卡氏菌科、链霉菌科及UBA11063四个科的BGC密度尤为突出，均超过3个/Mbp。值得注意的是，数据集中的Aquella物种展现出极高的BGC丰度，且这些基因簇绝大多数为非核糖体肽合成酶（NRPS）型BGC。
图3 a图：基于图1d（左）构建的高质量连续组装序列系统发育树，右侧显示每兆碱基对（Mbp）对应的细菌基因簇（BGCs）数量。b图：代表性组装结果展示未充分覆盖的分类群扩展情况[3]。
操纵子、防御系统
三代宏基因组使得组装的连续性得到了显著的提升，这就意味着复杂基因组区域的组装效果得到改善。长读长测序获得的MAGs具有一项优势：其大多包含核糖体RNA（rRNA）操纵子，可直接与数千个已有的16S rRNA数据集及大型数据库进行比对。在陆地复杂生境研究中[4]，借助三代纳米孔宏基因组测序，完整操纵子形式的rRNA基因获取效率大幅提高（下图），同时防御基因岛（尤其是CRISPR-Cas簇）的完整性也更高。而且，在该研究中也获得了更完整的生物合成基因簇（BGCs），与其他短读长获得的结果相比，该研究中的得到的完整的BGCs的数量中位数是其的6.1倍。
图4 大规模陆地环境研究中MAG组装结果比较。在MAGs中预测的rRNA操纵子(c)、防御岛(d)和BGCs (e)的基因簇总数[4]。
挖掘细胞外遗传元素Inocle
质粒等染色体外遗传元件能赋予宿主细菌环境应激抵抗能力（包括抗生素耐药性）。然而，这些元件的遗传多样性及其在适应性中的功能作用，由于二代测序的局限性，目前还很不完善。
25年新发表在NC上研究口腔微生物的文章中[5]，借助三代宏基因组技术发现了一种名为“Inocle”的巨大细胞外遗传元素，其可能在口腔微生物适应性进化中扮演着重要角色，甚至有望成为某些癌症的新型生物标志物。三代纳米孔宏基因组分析，85个因携带大量未知功能基因被特别认定为潜在新型遗传元件，将该新型遗传元件命名为“Inocle”，其代表人类口腔微生物组中新型ECEs。研究利用InoC，深入探究Inocle家族重叠群的全球流行情况，鉴定出29个完整的环状Inocle contigs，同时利用公共数据唾液宏基因组比较Inocle地理分布、流行率。
图5 四种Inocle分类群的鉴定与特征描述[5]。
综上，三代宏基因组技术可突破长复杂区域组装瓶颈，显著提升单菌基因组组装质量，大量获取高质量宏基因组组装基因组（MAGs）。同时，在多个研究领域均有显著的优势，其能深入挖掘抗性基因/功能基因，系统解析质粒组（Plasmidome）和移动组（Mobileome）的遗传特征，为微生态领域的高水平研究提供关键支撑。
参考文献
[1] Short- and long-read metagenomics uncover the mobile extended spectrum β-lactamase (ESBL) and carbapenemase genes in hospital wastewater in Sri Lanka. Water Research, 2025.
[2] Expanded catalogue of metagenome-assembled genomes reveals resistome characteristics and athletic performance-associated microbes in horse. Microbiome, 2023.
[3] Bioactive molecules unearthed by terabase-scale long-read sequencing of a soil metagenome. Nature Biotechnology, 2025.
[4] Genome-resolved long-read sequencing expands known microbial diversity across terrestrial habitats. Nature Microbiology, 2025.
[5] Giant extrachromosomal element “Inocle”potentially expands the adaptive capacity of the human oral microbiome. Nature Communications, 2025.
