转录组组装实战指南：3 种主流形式
转录组组装是高通量 RNA-seq 数据分析的核心环节，不同研究场景（有无参考基因组、研究物种类型）需选择适配的组装策略。本文梳理了Trinity 无参考组装、Trinity 有参考引导组装、Hisat2+Stringtie 参考基因组组装三种主流形式，全程保留原始代码与核心参数，仅做逻辑润色和实操解读，新手可直接复制运行。
01 Trinity 无参考基因组组装（De novo）
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适合无参考基因组 / 基因组质量差的物种（如非模式生物、新测序物种），也是真菌 / 细菌等小基因组的首选（需加特定参数），核心是基于 k-mer 拼接出完整转录本，后续可通过去冗余、筛选最长转录本优化结果。
1.1 核心参数说明
| 参数 | 含义 | 实操注意 |
|---|---|---|
--seqType fq | 指定输入序列格式为 fastq | 若为 fasta 格式则改为fa |
--CPU 64 | 调用 CPU 核心数 | 按需调整，建议≥16，越多越快 |
--max_memory 500G | 最大使用内存 | 小数据可设为 100G/200G，避免内存不足报错 |
--full_cleanup | 组装完成后删除中间文件 | 节省磁盘空间，建议添加 |
--jaccard_clip | 高基因密度物种专用（真菌 / 细菌） | 小基因组必须加，避免过度拼接 |
1.2 不同测序数据的组装指令
（1）双端测序数据（最常用）
Trinity --seqType fq --left reads_1.fq --right read_2.fq --output trinity_tdn_out --CPU 64 --full_cleanup --max_memory 500G # 真菌/细菌小基因组需添加--jaccard_clip Trinity --seqType fq --left reads_1.fq --right read_2.fq --output trinity_tdn_out --CPU 64 --full_cleanup --max_memory 500G --jaccard_clip（2）单端测序数据
Trinity --seqType fq --single reads.fq --output trinity_tdn_out --CPU 64 --full_cleanup --max_memory 500G（3）单双端数据结合（特殊场景）
需先合并数据（合并方法参考：https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/How-do-I-combine-reads%3F），再运行组装：
Trinity --seqType fq --single combined_reads.fastq --no_normalize_reads --run_as_paired --output rinity_tdn_out_denovo --CPU 64 --full_cleanup --max_memory 500G1.3 组装后优化（关键步骤）
（1）去除冗余序列（CD-hit-est）
组装结果会存在重复转录本，需用cd-hit-est去冗余，参数-c 0.9表示序列相似度≥90% 即判定为冗余：
cd-hit-est -i trinity_tdn_out_denovo.Trinity.fasta -o new.fa -c 0.9 -n 10 -M 0 -T 0 1>cdhit.log 2>&1-M 0：不限制内存使用；-T 0：自动调用所有可用 CPU；日志输出到cdhit.log，方便排查报错。
（2）提取 accession 号（后续注释用）
~/software/PASApipeline.v2.5.3/misc_utilities/accession_extractor.pl trinity_tdn_out.Trinity.fasta > tdn.accession（3）统计组装结果（评估质量）
生成组装报告，包含转录本数量、长度分布、N50 等核心指标，是判断组装质量的关键：
~/miniconda3/envs/Trinity/bin/TrinityStats.pl trinity_tdn_out_denovo.Trinity.fasta > assembly_report.txt（4）筛选最长转录本（构建 unigene）
同一基因会拼接出多个可变剪接本，筛选最长转录本作为 unigene，便于后续功能注释：
~/miniconda3/envs/Trinity/bin/util/misc/get_longest_isoform_seq_per_trinity_gene.pl trinity_tdn_out_denovo.Trinity.fasta > unigene.fasta02 Trinity 有参考基因组引导组装（Genome Guide）
适合有高质量参考基因组的物种，先将 RNA-seq 数据比对到基因组，再基于比对结果组装，精度远高于无参考组装。
2.1 前置步骤：合并多样本比对结果
若有多个样本的 bam 文件，需先合并（提高组装完整性）：
samtools merge -@ 48 -o rnaseq_merge.bam \ ERR392009.sorted.bam SRR7883198.sorted.bam SRR13870117.sorted.bam-@ 48：调用 48 个 CPU 线程；替换为实际样本的 bam 文件名，需是排序后的 bam（sorted.bam）。
2.2 核心组装指令
Trinity --genome_guided_bam rnaseq_merge.bam --output trinity_GG_out --genome_guided_max_intron 100000 --CPU 48 --full_cleanup --max_memory 500G--genome_guided_max_intron 100000：设置最大内含子长度为 100kb，适配大多数真核生物（植物 / 动物可按需调整，如植物设为 50000）。
2.3 去冗余优化
与无参考组装一致，去除冗余序列，提升后续分析效率：
cd-hit-est -i trinity_GG_out.Trinity-GG.fasta -o new.fa -c 0.9 -n 10 -M 0 -T 003 Hisat2+Stringtie 组装（参考基因组最优解）
Hisat2（序列比对）+ Stringtie（转录本组装）是有参考基因组时的黄金组合，比 Trinity 有参考组装更精准，尤其适合可变剪接分析、基因表达定量。
3.1 批量处理多样本（for 循环实操）
for sample in ERR392009 SRR7883198 SRR13870117 do echo "开始处理 $sample ..." ## Step1: Stringtie组装转录本（基于比对后的sorted.bam） stringtie ${sample}.sorted.bam -o ${sample}.rnaseq.gtf -p 64 ## Step2: 合并所有样本的gtf文件（构建统一转录本集） stringtie --merge -o stringtie_transcripts.gtf gtf_files.txt -p 64 ## Step3: 提取ORF（开放阅读框）信息（编码区预测） ### 3.1 提取cDNA序列 ~/software/TransDecoder-TransDecoder-v5.7.1/util/gtf_genome_to_cdna_fasta.pl \ stringtie_transcripts.gtf genome.fasta.masked >stringtie_transcripts.fasta ### 3.2 GTF格式转GFF3（适配TransDecoder） ~/software/TransDecoder-TransDecoder-v5.7.1/util/gtf_to_alignment_gff3.pl \ stringtie_transcripts.gtf >stringtie_transcripts.gff3 ### 3.3 提取最长开放阅读框 ~/software/TransDecoder-TransDecoder-v5.7.1/TransDecoder.LongOrfs \ -t stringtie_transcripts.fasta ### 3.4 预测编码区 ~/software/TransDecoder-TransDecoder-v5.7.1/TransDecoder.Predict \ -t stringtie_transcripts.fasta ### 3.5 生成基因组水平的ORF GFF3文件 ~/software/TransDecoder-TransDecoder-v5.7.1/util/cdna_alignment_orf_to_genome_orf.pl \ stringtie_transcripts.fasta.transdecoder.gff3 \ stringtie_transcripts.gff3 \ stringtie_transcripts.fasta \ > stringtie_transcripts.fasta.transdecoder.genome.gff3 ### 3.6 筛选完整编码区的基因GFF3 grep ">" stringtie_transcripts.fasta.transdecoder.cds \ |grep "complete" |sed 's#>##' |sed 's#\s.*##' \ > stringtie_accs.txt grep -f stringtie_accs.txt stringtie_transcripts.fasta.transdecoder.genome.gff3 \ >stringtie_trandecoder.cds.complete.gff3 echo "$sample 处理完成，日志保存到 ${sample}.log" done3.2 关键步骤解读
- Stringtie 组装：
-o指定输出 GTF 文件（转录本结构注释），-p 64调用 64 线程； - GTF 合并：
--merge参数整合多样本的转录本，消除样本间的组装差异，构建更完整的转录本集； - ORF 预测：通过 TransDecoder 完成编码区预测，筛选
complete（完整 ORF）的序列，是后续蛋白功能分析的基础； - 格式转换：GTF 转 GFF3 是为了适配多数功能注释工具（如 MAKER、InterProScan）的输入要求。
04 三种组装形式对比与选择建议
| 组装形式 | 适用场景 | 优势 | 劣势 |
|---|---|---|---|
| Trinity 无参考 | 无参考基因组 / 新物种 | 无需基因组，通用性强 | 组装精度低，冗余度高，耗时久 |
| Trinity 有参考引导 | 有参考基因组，追求便捷 | 操作简单，兼容 Trinity 生态 | 精度低于 Hisat2+Stringtie |
| Hisat2+Stringtie | 有高质量参考基因组 | 组装精度最高，支持可变剪接 / 定量 | 步骤稍多，依赖基因组注释质量 |
实操总结
- 无参考基因组：优先选 Trinity 无参考组装，务必加
--jaccard_clip（小基因组）、后续去冗余 + 筛选最长转录本； - 有参考基因组：首选 Hisat2+Stringtie，精度更高；若追求便捷，可选 Trinity 有参考引导组装；
- 核心参数：CPU 和内存按需调整，小数据（<100G）可降低内存至 100-200G，避免资源浪费；
- 质量评估：组装后务必运行
TrinityStats.pl统计结果，重点关注 N50（越高越好）、转录本长度分布、完整 ORF 比例。
