引言
空间转录组（Spatial Transcriptomics, ST）技术在传统转录组与单细胞转录组的基础上，引入了空间位置信息，使研究者能够在组织结构背景下解析基因表达模式。相较于下游分析中对空间结构、生物学机制的深入挖掘，上游分析的核心目标在于：将测序原始数据转换为高质量、可用于空间建模和生物学解释的表达矩阵与空间坐标信息。
空间转录组的上游分析直接决定了后续空间聚类、空间差异基因、空间通讯等分析的可靠性。因此，系统、规范地理解其上游分析流程具有重要意义。
空间转录组数据类型概述
不同空间转录组技术路线，其上游数据形态与处理方式存在一定差异，但总体可归纳为以下几类：
1. 基于捕获芯片的空间转录组（如 10x Visium）
原始数据：FASTQ
空间信息来源：芯片上固定位置的 barcode
特点：一个 spot 通常包含多个细胞
2. 原位杂交/成像型空间转录组（如 MERFISH、seqFISH）
原始数据：显微图像
空间信息来源：细胞或分子级坐标
特点：空间分辨率高，基因数相对受限
3. 组织切片测序型（如 Slide-seq、Stereo-seq）
原始数据：FASTQ + bead 坐标文件
特点：高分辨率、大规模空间点位
本文重点以尤其是 10x Visium为代表，系统介绍其上游分析流程，需要sratoolkit与Space Ranger
安装
sratoolkit官网安装
01. Downloading SRA Toolkit · ncbi/sra-tools Wiki · GitHubhttps://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
下载的为Ubuntu Linux X64 wget -c https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.3.0/sratoolkit.3.3.0-ubuntu64.tar.gz 解压即可 tar -zxvf sratoolkit.3.3.0-ubuntu64.tar.gz 可选择添加到环境变量 export PATH=$PATH:$PWD/sratoolkit.3.3.0-ubuntu64/binSpace Ranger官网安装
Space Ranger | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest
下载Space Ranger wget -O spaceranger-4.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/spatial-exp/spaceranger-4.0.1.tar.gz?Expires=1766082461&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=ehvI5hDYu5uCFb36xyvl-97DQS6mnL506M58Xf5uVC4q33IHmkqx8qx81Ifm3-xAMhKz453qkl~onEejVL~rVQsW4Dtf32sJkDyTBoQtG8WDzTJuoGQk9uIpszGovFixWWuluoxvH2bYAJZH90yNTVz746Iq3DXuveCD0j2gEUiB20~DTPfPkWoMPACy1B2Vd2l2kUE-aG2NcCLtgvvYA0ktj9~SEf299BaD19tkZlWbIvQPbkJomCIG4csLr~69UmTKjOpr~K-1TNw1gc1cq429uREdJJMMlzd6PWfgaIPZu9wLCUJJVcBCcyuYtiJmFUUa79NTInJXei1RbMWPvQ__" 解压 tar -zxvf spaceranger-4.0.1.tar.gz 添加到环境变量 export PATH=$PATH:$PWD/spaceranger-4.0.1-ubuntu64/bin 下载参考基因组 人 wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz" 解压 tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz Mouse wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz" Rat wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mRatBN7-2-2024-A.tar.gz"下载数据
选择的数据SRR编号为SRR27277620，GEO编号为GSM7980872，组织类型：甲状腺癌，临床分型：ATC
空间转录组的上游分析不仅需要fastq文件，还需要一个HE组织染色图像。
图像一般都在GEO数据库的补充文件中
第四个下载解压即可
prefetch --max-size 100G SRR27277620 将下载的sra转为fastq fasterq-dump SRR27277612.sra -O fastq_store -e 20 --include-technical 修改名字 mv SRR27277612_1.fastq SRR27277612_S1_L001_R1_001.fastq mv SRR27277612_2.fastq SRR27277612_S1_L001_R2_001.fastq注意sra转为fastq过程中：--include-technical→ 保留空间转录组必需的技术读段
转完格式之后，必须将fastq名称修改为Space Ranger规定的格式
<样本名>_<S编号>_<Lane编号>_<Read类型>_<001>.fastq.gz| 组成部分 | 格式示例 | 含义说明 | 必需性 | Spaceranger 匹配规则 |
|---|---|---|---|---|
| 样本名 | PTC,sample1 | 样本标识符，与--sample参数一致 | 必需 | 通过--sample指定前缀 |
| S编号 | S1,S2 | 样本在测序中的编号 | 通常必需 | 自动识别，无需指定 |
| Lane编号 | L001,L002 | 测序 lane 编号 | 通常必需 | 自动按 lane 分组配对 |
| Read类型 | R1,R2,I1 | 读段类型 | 必需 | 自动配对 R1↔R2 |
| 文件编号 | 001,002 | 文件批次编号 | 通常为001 | 自动识别 |
一般只有R1和R2两个fastq文件，也有的会有I1文件
| 文件类型 | 标准命名 | 主要功能 | 内容长度 | 在空间转录组中的用途 |
|---|---|---|---|---|
| R1 (Read 1) | *_R1_*.fastq.gz | 空间barcode + UMI | 28 bp (Visium v1) | 识别spot位置和分子计数 |
| R2 (Read 2) | *_R2_*.fastq.gz | cDNA序列 | 50-150 bp | 基因识别和定量 |
| I1 (Index 1) | *_I1_*.fastq.gz | 样本index | 8-10 bp | 多样本混合时区分样本 |
上游分析
前期处理好之后就开始进行空转上游处理
在运行spaceranger count时，组织图像与芯片坐标的对齐（image alignment）是一个关键步骤。Space Ranger 实际上提供了两种对齐策略：
- 自动对齐（Automatic alignment）：由 Space Ranger 在 count 过程中自动完成
- 手动对齐（Manual alignment）：借助 Loupe Browser 预先完成人工校准，再由 Space Ranger 读取结果
自动对齐
spaceranger count \ --id=ATC \ --transcriptome=/home/duyo/data_251215/huma_data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \ --fastqs=/home/duyo/data_251215/SRR27277612data/SRR27277612/fastq_store/ \ --sample=SRR27277612 \ --image=./GSM7980872_ATC-1_visium_tissue_hires_image.png \ --unknown-slide visium-1 \ --localcores=16 \ --localmem=64 \ --create-bam false--id分析任务名称，同时作为输出目录名。--transcriptome指定 10x 官方格式的人类参考转录组（GRCh38）。--fastqsFASTQ 文件所在目录。--sample指定需要分析的样本名，用于匹配 FASTQ 文件。--image组织切片图像（H&E），用于空间对齐和 in-tissue 判定。--unknown-slide指定芯片类型为标准 10x Visium（无芯片序列号时使用）。
如果知道芯片编号可以使用 --slide=V19J01-123
不知道芯片序列需要使用--unknown-slide选择芯片的类型，后面必须指定以下之一
visium-1→ 第一代 Visium 载玻片（标准 6.5mm 捕获区）visium-2→ 第二代 Visium 载玻片（新版设计）visium-2-large→ 第二代大尺寸载玻片visium-hd→ 高分辨率 Visium HD 载玻片
--localcores使用多少个 CPU 核心进行计算。--localmem分配多少内存供分析使用。--create-bam false不生成 BAM 文件，以节省磁盘空间。
当看到这几行时说明运行成功了！！
手动对齐
需要下载Loupe Browser进行对齐，下载连接与教程连接
Loupe Browser | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/loupe-browser/latest对齐之后会输出一个json文件，使用--loupe-alignment指定该文件
例如
spaceranger count \ --id=ATC \ --transcriptome=/home/duyo/data_251215/huma_data/refdata-gex-GRCh38-2024-A \ --fastqs=/home/duyo/data_251215/SRR27277612data/SRR27277612/fastq_store/ \ --sample=SRR27277612 \ --image=./GSM7980872_ATC-1_visium_tissue_hires_image.png \ --unknown-slide visium-1 \ --localcores=16 \ --localmem=64 \ --create-bam false \ -loupe-alignment=SRR27277612.json输出内容说明
不同的芯片格式输出内容不同（所以分析时最好有芯片序列号），参考官网说明
Understanding Space Ranger Outputs | Official 10x Genomics Supporthttps://www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest/analysis/outputs/output-overview
使用芯片Visium HD 或 Visium HD'3
| 文件或目录名称 | 描述 |
|---|---|
barcode_mappings.parquet | 该文件高效存储空间映射信息，本质上作为CSV文件，追踪Visium HD数据中条码（方块）、核、单元和箱之间的关系。详情请参见分段输出页面。 |
binned_outputs | 默认情况下，该目录有三个子目录：、、和。每个目录包含 、 、 、 和 。该目录仅提供8微米和16微米的频箱尺寸。仅提供8微米的箱体尺寸。仅提供2微米分辨率。square_002umsquare_008umsquare_016umfiltered_feature_bc_matrixraw_feature_bc_matrixspatialfiltered_feature_bc_matrix.h5raw_feature_bc_matrix.h5analysiscloupe.clouperaw_probe_bc_matrix.h5 |
cloupe_008um.cloupe | 与 .cloupe 文件的 8 微米 bin 尺寸有对称链接 |
cloupe_cell.cloupe | 与.cloupe文件的单元格分段的对称链接 |
feature_slice.h5 | 一种专为 Visium HD 设计的新文件类型，支持高效获取单个或多个基因的 2 微米分辨率图像切片。详情请见此页面。 |
metrics_summary.csv | 以CSV格式运行汇总指标 |
molecule_info.h5 | 包含所有含有有效条形码、有效UMI且高度确定分配给基因条码或bin的分子的每分子信息。 |
probe_set.csv | 输入探针集的副本，参考CSV文件。 |
segmented_outputs | 包含分段输出的文件夹。包含 ， ， ， ， ， 和 。详情请参见分段输出页面。analysiscell_segmentations.geojsoncloupe.cloupefiltered_feature_cell_matrixfiltered_feature_cell_matrix.h5graphclust_annotated_cell_segmentations.geojsongraphclust_annotated_nucleus_segmentations.geojsonnucleus_segmentations.geojsonraw_feature_cell_matrixraw_feature_cell_matrix.h5spatial |
spatial | 包含数据空间性的输出文件夹。更多详情请参见空间输出页面。 |
web_summary.html | 以HTML格式运行汇总指标和图表 |
使用Visium v1/v2
| 文件或目录名称 | 描述 |
|---|---|
web_summary.html | 以HTML格式运行汇总指标和图表 |
cloupe.cloupe | 放大镜浏览器可视化与分析文件 |
spatial/ | 包含数据空间性的输出文件夹。 |
analysis/ | 包含次级分析数据的文件夹，包括基于图的聚类和K均值聚类（K = 2-10）;簇间的基因表达差异;PCA、t-SNE和UMAP降维。 |
metrics_summary.csv | 以CSV格式运行汇总指标 |
probe_set.csv | 输入探针集的副本，参考CSV文件。关于Visium FFPE和CytAssist工作流程的呈现 |
possorted_genome_bam.bam | 索引BAM文件，包含位置排序的读段，与基因组和转录组对齐，并附有条形码信息 |
possorted_genome_bam.bam.bai | 索引。如果参考转录组是从染色体非常长的基因组（>512 Mbp）生成的，Space Ranger v2.0+ 会生成索引文件。possorted_genome_bam.bampossorted_genome_bam.bam.csi |
filtered_feature_bc_matrix/ | 仅包含MEX格式的组织相关条码。矩阵中的每个元素分别是与特征（行）和条码（列）相关的UMI数量。该文件可以输入第三方软件包，允许用户作条码特征矩阵（例如过滤异常点、运行降维、规范基因表达）。 |
filtered_feature_bc_matrix.h5 | 信息与HDF5格式相同。filtered_feature_bc_matrix/ |
raw_feature_bc_matrices/ | 包含所有检测到的MEX格式条码。矩阵中的每个元素分别是与特征（行）和条码（列）相关的UMI数量。 |
raw_feature_bc_matrix.h5 | 信息与HDF5格式相同。raw_feature_bc_matrices/ |
raw_probe_bc_matrix.h5 | 包含所有检测到的条码的每个探头的UMI计数，格式为HDF5格式。仅在运行探针检测管道时生产。 |
molecule_info.h5 | 包含所有含有有效条形码、有效UMI且高度置信度地分配给基因或蛋白质条码的分子的每分子信息。该文件对于包括 、 和 在内的其他分析管道是必需的。spacerangeraggrtargeted-comparetargeted-depth |
但是一般分析完成之后，我们所需的下游分析所需文件主要集中于outs文件
outs ├── aggregation.csv ├── aggr_tissue_positions.csv ├── analysis │ ├── clustering │ ├── diffexp │ ├── pca │ ├── tsne │ └── umap ├── cloupe.cloupe ├── filtered_feature_bc_matrix │ ├── barcodes.tsv.gz │ ├── features.tsv.gz │ └── matrix.mtx.gz ├── filtered_feature_bc_matrix.h5 ├── spatial │ ├── LV123 │ │ ├── scalefactors_json.json │ │ ├── tissue_hires_image.png │ │ └── tissue_lowres_image.png │ ├── LB456 │ │ ├── scalefactors_json.json │ │ ├── tissue_hires_image.png │ │ └── tissue_lowres_image.png │ └── LP789 │ ├── scalefactors_json.json │ ├── tissue_hires_image.png │ └── tissue_lowres_image.png ├── summary.json └── web_summary.html
