NAR | 非CG甲基化可促进TF结合！福农朱方捷/上交九院黄晶解析WRKY顺式元件组-程序员充电站

摘要：

DNA甲基化是最早被鉴定的表观修饰。动物基因组中DNA甲基化通常发生于CG二核苷酸，然而，植物中除CG甲基化外，还存在大量非CG甲基化（CHG和CHH，H=A/G/T）。非CG甲基化对植物转座子沉默至关重要，同时也常见于启动子区（如CHH island）。前期研究认为，非CG甲基化抑制转录因子（TF）结合^1,2。然而，该结论假设DNA甲基化不改变TF序列特异性（即不改变TF基序），假设未必成立。

近日，福建农林大学·海峡联合研究院朱方捷教授团队联合上海交通大学医学院附属第九人民医院·上海精准医学研究院黄晶研究员团队，开发了高通量全甲基化系统进化技术methyl-SELEX与methyl-ampDAP-seq，并利用其构建了54个WRKY家族TFs的461个顺式元件组文库。数据分析表明，非CG甲基化可显著改变WRKY序列特异性，且甲基化对WRKY亲和力的调控具明显双向性——取决于结合模式、位置、以及具体WRKY因子，非CG甲基化既可抑制、也可促进TF结合。同时，本工作提供了目前最完整的WRKY家族顺式元件组数据集，构建了WRKY数据库WRCD（https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）。

本研究于2025年11月20日在Nucleic Acids Research（IF=13.1）在线发表，题为“The specificity landscape of WRKY transcription factors reveals the bidirectional influence of non-CG methylation”。

亮点：

•开发了高通量全甲基化顺式元件组鉴定技术。

•提供最完整的WRKY顺式元件组图谱，发现新型WRKY顺式元件。

•揭示非CG甲基化对WRKY亲和力的双向调控。

•构建WRKY顺式元件组数据库WRCD。

内容概要：

本工作以拟南芥WRKY家族TFs为研究对象，利用SELEX、DAP-seq、ampDAP-seq以及建立的高通量methyl-SELEX、methyl-ampDAP-seq，系统研究了54个WRKY转录因子在非甲基化、体内天然甲基化、全甲基化背景下的序列特异性及全基因组顺式元件位点。共整理出201个WRKY单体基序（图1上）。本工作既鉴定到WRKY家族传统的顺式元件，如W-box与WT-box，也鉴定到了大量新型WRKY顺式元件。所有单体基序可聚为11类（图1下），其中5类为首次报道的WRKY家族序列特异性（图1下，粗体注释的class）。11类单体基序中，类别1-5为非甲基化时WRKY的识别基序，类别6-11为甲基化时WRKY的识别基序，表明甲基化可显著改变WRKY的序列特异性。此外，对于已报导的WRKY顺式元件PRE4，分析表明其仅在甲基化条件下可被WRKY识别。

图1：各WRKY识别的单体基序

本工作进一步分析了有/无甲基化条件下WRKY二聚体的序列特异性，结果表明，甲基化不仅改变WRKY单体结合的序列特异性，也改变WRKY同源二聚体的序列特异性。

随后，本工作系统解析了DNA甲基化对WRKY亲和力的影响（图2），证明了甲基化的影响具有明显双向性。（1）对于不同WRKY结合模式，其亲和力对甲基化的响应不同（图2A）：尽管WRKY识别的非甲基化、甲基化基序中均含有C（或G），但对于非甲基化时WRKY识别的基序，相关序列甲基化时亲和力减弱；对于甲基化时WRKY识别的基序，相关序列甲基化时亲和力增强。（2）对于WRKY基序中不同位置的C，甲基化的影响也不同（图2C、E）。例如对所有WRKY，C4位的DNA甲基化均减弱其亲和力，但C7位的甲基化对亲和力的影响则具多样性——增加WRKY29/35等的亲和力，但减弱WRKY46/65等的亲和力。（3）此外，DNA甲基化不但双向影响5mC自身与WRKY的亲和力，也同时双向影响附近A/T碱基的亲和力（图2F-H）。

进一步比较ampDAP-seq与methyl-ampDAP-seq文库表明，甲基化时，WRKY结合的全基因组顺式元件也发生明显的变化。然而，甲基化条件下，WRKY识别的顺式元件仍靶向WRKY的经典功能（SA通路、免疫反应等），因此推测植物基因组中的甲基化顺式元件也参与构建了WRKY下游的转录调控网络，对WRKY行使正常生理功能具有重要意义。

图2：甲基化既可促进，也可抑制WRKY结合

最后，为促进数据共享，本研究整合新产生数据与先前已发表的WRKY顺式元件组数据，构建了WRCD数据库（图3，https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）

图3：WRKY顺式元件组数据库

综上，本研究绘制了WRKY顺式元件组图谱，揭示了非CG甲基化可双向影响WRKY亲和力，并可重塑WRKY的下游转录调控网络。所揭示的双向性影响为合成生物学中顺式元件的设计提供了重要参考：例如植物转基因时，外来基因常被DNA甲基化沉默，根据本研究数据，有望设计出甲基化条件下仍能结合TF并促进转录的顺式元件。

福建农林大学生命科学学院已毕业博士研究生马娜娜、已毕业硕士研究生蒋定坤、未来技术学院博士研究生李甜、浙江大学博士后罗琳为该论文共同第一作者。福建农林大学海峡联合研究院朱方捷教授、生命科学学院郭洪洪讲师、上海精准医学研究院黄晶研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、福建省“雏鹰计划”、福建省重大专项以及福建农林大学的资助。

原文链接：

https://academic.oup.com/nar/article/53/21/gkaf1168/8328560?searchresult=1

参考文献：

1. Charvin, M.et al. Single-cytosine methylation at W-boxes repels binding of WRKY transcription factors through steric hindrance. Plant Physiol.192, 77–84 (2023).

2. O’Malley, R. C.et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape. Cell165, 1280–1292 (2016).