细节分享--关于高精度（Xenium、CosMx）细胞分割外基因表达的分析讨论

作者，Evil Genius

北国风光

今天我们来扩展细节分析，那就是基于成像的空间转录组学（iST）能够在空间背景中可视化RNA分子，但多达40%的转录本未被分配到细胞，但是uRNA（unassigned RNA）的生物学意义以及分析，目前一般都是不考虑，今天我们来讨论一下。

问题发现：iST 数据中高达 40% 的转录本未被分配到细胞，成为 uRNA，常被忽视。

研究目标：系统性分析 uRNA，区分其技术来源与生物意义。

关键发现：约 1/3 uRNA 有生物来源，富集于神经元等复杂形态细胞周围，与细胞突起、细胞间接触相关。

挑战认知：uRNA 不全是技术噪声，可能包含重要的生物学空间信息。

分析结果1、误分割是未分配RNA的主要来源

iST数据中uRNA普遍存在且比例高，分割策略是关键影响因素。

即使应用最先进的分割方法，仍有大量uRNA无法消除，且其组成稳定。

新分析方法表明，大部分uRNA来源于被分割遗漏的类细胞区域，证实误分割是主要原因。

误分割的影响具有组织/细胞类型特异性，与组织结构复杂性相关。

结果2、量化噪声和扩散对未分配RNA的影响

平均43.2%的uRNA无法用误分割解释，可能源于其他技术性因素，主要是技术噪声和RNA扩散。

1. 技术噪声评估：

利用部分iST平台的阴性对照探针或自定义方法估计噪声阈值。

各数据集中，平均42%的基因其uRNA丰度低于噪声阈值，主要由技术噪声造成，但组织间差异大。

2. RNA扩散评估：

将RNA扩散定义为转录本从起源细胞被动扩散到附近位置被检测到。

在iST中，扩散现象研究较少。组织切片具有伪三维几何结构，建模复杂。

为简化分析，将扩散建模为二维过程，假设uRNA来自附近表达相同基因的细胞，并测量未分配转录本到最近表达细胞的距离。

理论上，点源的被动扩散会产生瑞利分布的距离分布。

比较实际距离分布与Rayleigh distribution的预期发现，实际分布显著偏离瑞利预期，表明被动扩散不能完全解释观察到的整体uRNA模式。

但扩散贡献存在基因特异性：平均31.1%的基因其uRNA距离分布与Rayleigh model一致，符合扩散特征。

综合定量总结：

通过对三大技术来源进行系统量化，uRNA的组成比例如下：

误分割：56.8%（主要来源）

技术噪声：3.1%

符合扩散模式的信号：11.4%

无法用上述技术原因解释的uRNA：28.7%

这剩余近三分之一的uRNA（特别是富含在脑、骨等具有复杂细胞形态的组织中）可能具有生物学起源，为后续研究其生物意义奠定了基础。

核心结论： 研究明确量化了uRNA的主要技术来源，并揭示出相当一部分uRNA无法用现有技术模型解释，强烈暗示其潜在的生物学重要性。

结果3、基因特异性uRNA分布揭示不同的起源和行为

为了理解与技术假象无关的uRNA，分析了其特征，发现不同基因的uRNA丰度和比例存在显著差异，部分基因在uRNA池中高度富集，且与特定细胞类型及其不规则形态相关。

关键发现：

基因特异性的uRNA富集模式

示例1（黑色素瘤数据）：角蛋白基因（KRT1, KRT10等）在复层鳞状上皮细胞中表达，但uRNA比例极高（>30%）。

示例2（小鼠结肠数据）：肠胶质细胞标志物Gfap的uRNA比例最高（23.3%），显著高于同一细胞类型的其他标志物（如Sox2、Plp1仅约10%）。

机制关联：这种差异与已知的RNA亚细胞定位知识一致（例如，Gfap RNA已知定位于胶质细胞突起，而Sox2作为核转录因子停留在细胞核内），提示uRNA可能反映了主动的mRNA运输到特定亚细胞结构（如细胞突起），形成了与细胞本体不同的空间RNA特征。

uRNA具有独立的空间模式

对于多数基因，其在已分割细胞内的表达空间模式与其uRNA的空间模式相关性很低。

典型例证（小鼠脑）：基因Ppp1r16b的uRNA在齿状回分子层高度富集并形成独特的空间聚集模式，而其表达细胞本体却位于颗粒层。这与该基因已知在神经元树突中富集的报道相符，强烈提示这些uRNA来源于细胞的树突等远端突起。

跨平台一致性证实生物学起源

使用不同iST平台（Xenium和CosMx）对生物学上等价的小鼠海马体样本进行分析比较。

结果发现，单个基因的uRNA丰度、空间自相关性和uRNA比例在平台间呈现强相关性。

特别是在两个平台的uRNA池中共同高度富集的基因，多是与突触可塑性相关且已知定位于细胞突起的基因（如Camk2a, Ckb, Snap25）。

核心结论：

研究揭示了uRNA具有基因和细胞类型特异性。其富集模式与细胞的复杂形态和已知的RNA亚细胞定位知识吻合。uRNA常表现出独立于细胞本体的独特空间分布，并与细胞远端结构（如树突）相关。最重要的是，这些信号在不同技术平台间表现出一致性，强有力地证明相当一部分uRNA并非技术假象，而是反映了真实的生物学过程，特别是与细胞内RNA定位和细胞形态相关。

结果4、uRNA的空间模式反映了细胞外躯体结构

研究发现，部分基因的uRNA呈现出独特的空间特征，可能反映了协调的表达程序。通过非细胞假设的网格化分析，揭示了uRNA空间模式与已知脑解剖结构相对应，且通常不与任何特定细胞类型的表达或位置重合。

关键分析方法与发现：

非偏倚网格分析：将组织划分为 10×10 μm 网格单元，分析每个单元内的uRNA分子组成，避免了关于细胞或解剖结构的先验假设。

揭示解剖级结构：基于分子相似性识别的uRNA聚类与已知脑解剖结构（如海马亚区、胼胝体）高度吻合，表明uRNA能捕捉组织层面的空间结构信息。

识别驱动uRNA异质性的基因程序：

应用非负矩阵分解（NMF） 和非线性模型（DRVI） 等方法，识别驱动uRNA空间变异的潜在维度（DRs）。

发现了总计20个驱动维度（DRs），可分为不同类型：

细胞类型相关DRs：例如DR10（小胶质细胞）、DR16（少突胶质前体细胞），这与误分割来源一致。

同一细胞类型内的亚细胞定位DRs：例如，同样关联于CA1-CA2锥体神经元的DR3和DR11展现出截然不同的空间模式。DR3由Arc、Fibcd1等驱动，分布在整个CA1-CA2区域，反映了树突定位；而DR11由Spink8、Grem1等标记，定位于锥体细胞层附近，提示不同的亚细胞或功能分区。

区域特异性DRs：例如DR1（胼胝体）、DR4（齿状回分子层），代表了组织域层面的特异性。

与形态学染色的关联：uRNA变异模式部分地与形态学染色（如18S染色）的像素强度相关。细胞类型特异性DRs（如DR11）在高染色强度区域得分高，而区域特异性DRs（如DR1、DR4）则在所有染色均较弱的区域被识别，这可能反映了这些区域细胞密度低或存在非细胞结构。

跨组织普适性验证：在股骨（非神经组织） 的Xenium数据中同样应用此分析，识别出了仅存在于uRNA中的空间分布和分子特征（例如OGN和Aqp3基因在骨外周的模式），以及定位于无分割细胞的骨内部区域的uRNA特异性基因表达特征。

核心结论：

分析表明，uRNA的空间组织具有多层次的结构性，能够捕获从亚细胞定位（如树突）、细胞类型到组织解剖域等不同尺度的生物变异。这一现象不仅存在于复杂的脑组织，也存在于骨等其他组织中，暗示uRNA的规律性分布是跨组织的普遍现象，很可能与多样的生物过程（如细胞突起、细胞外基质、组织微环境） 相关。这进一步证明了uRNA具有重要的生物学意义，而非单纯的噪声。

结果5、未分配RNA为细胞内RNA定位模式和细胞结构提供新见解

研究表明，非技术性的uRNA能为已分割细胞提供补充信息。基于uRNA来源于组织细胞的假设，研究开发了两种互补的量化指标，并利用uRNA揭示了细胞外躯体RNA定位及细胞间相互作用。

核心方法与应用发现：

开发两种uRNA来源量化指标

uRNA贡献度分数：基于细胞的基因表达量，估计每个细胞对其基因所产生uRNA的贡献。在小鼠脑数据中，神经元亚型是主要贡献者。

uRNA来源分数：结合细胞的基因表达和空间邻近性（距离加权），计算每个细胞作为每个uRNA来源的概率并加和。该分数同时考虑了表达和空间信息。

标准化（单位细胞内转录本的uRNA期望值）后，内皮细胞和星形胶质细胞的分数最高，这既可能反映其形态复杂（分割困难），也可能反映其主动的RNA外输。

识别“无源”uRNA与发现

通过分析基因层面的来源分数，识别出一类uRNA比例高但来源分数异常低的基因（如Pou4f3, Apoa4）。这些uRNA无法追溯到任何已分割细胞。

有趣的是，许多这类转录本在胼胝体（富含髓鞘轴突的区域）空间富集，而轴突结构常被分割遗漏。部分基因（如Pou4f3）已知在采样区域外的神经元中表达，提示uRNA可能捕获了来自组织样本外或深部细胞的投射。

推断细胞外躯体（突起）中的RNA定位

利用uRNA来源分数，量化了不同基因和细胞类型在细胞突起中的转录本富集程度。

结果符合已知生物学：例如，参与核内RNA剪接的Rsrp1在所有细胞类型中外躯体富集度最低；而与轴突导向（Nsmf）或树突定位（Sptbn2）相关的基因，外躯体富集度最高。

使用数据中现有的核质分割作为验证，证实了该方法的准确性，但指出其对细胞质转录本存在系统性低估，因为缺乏局部胞体表达的远端转录本无法被溯源。

基于uRNA推断细胞间接触

开发了一个基于突起的评分框架：为每个uRNA推断其来源细胞和目标细胞，利用两者间的空间位移作为突起介导的细胞接触证据。

应用该框架于小鼠脑数据，成功复现了已知的细胞间相互作用，并揭示了标准以细胞为中心的方法无法检测到的、由突起介导的新型接触。

尤其突出的是，该方法凸显了星形胶质细胞介导的相互作用，这与它们复杂的形态及其与多种细胞类型接触的已知功能角色相符。

核心结论：

研究证明了uRNA不仅是待清理的“噪音”，更是一个宝贵的信息源。通过开发新的计算方法，能够：

量化细胞对其uRNA池的贡献。

识别可能来自远端投射或样本外细胞的“孤儿”转录本。

系统性地推断不同基因在细胞突起中的定位偏好。

重建基于细胞突起的细胞间接触网络，超越传统细胞分割的局限。

生活很好，有你更好，下一篇我们分享uRNA的分析代码。